打开文本图片集
[摘要] 目的 研究食管癌中CD137/CD137L的表达情况，并分析两者在食管癌中表达的意义及其与预后的关系。 方法 以购自上海芯超生物科技有限公司的食管癌组织芯片为研究对象，采用免疫组织化学方法检测组织芯片中87例食管癌组织及其相应的癌旁组织中CD137/CD137L的表达情况；采用χ2检验或Fisher"s精确检验的方法分析食管癌及癌旁组织中CD137/CD137L的表达与临床病理特征的关系；采用Kaplan-Meier法分析CD137/CD137L的表达与食管癌患者预后的关系。 结果 在87例食管癌组织和相应的癌旁组织中CD137的阳性表达率分别为36.8%和72.4%，两者比较差异有统计学意义（P < 0.05）。在87例食管癌组织和相应的癌旁组织中CD137L的阳性表达率分别为57.5%和96.6%，两者比较差异有统计学意义（P < 0.05）。食管癌中CD137表达阳性率与浸润深度相关（P < 0.05），而与年龄、性别、肿瘤部位、分化程度、临床分期均不相关（P > 0.05）。食管癌中CD137L表达与临床分期相关（P < 0.05），而与年龄、性别、肿瘤部位、分化程度、浸润深度均不相关（P > 0.05）。CD137表达与食管癌患者的预后不相关（P=0.6301），CD137L表达与食管癌患者的预后相关（P=0.0368）。 结论 CD137L的表达水平是影响食管癌患者预后的独立因素；CD137/CD137L可能在食管癌的抗肿瘤免疫中發挥重要作用。
[关键词] 食管癌；CD137；CD137L；预后
[中图分类号] R735.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）01（b）-0004-05
The expression of CD137/CD137L in esophageal cancer and its correlation with prognosis
JING He"nan1，2 LI Jingya1 XU Zhishan1 YANG Ru1 LU Ping2 ZHAO Baosheng3 ZHONG Genshen1，2
1.Research Center of Life Sciences & Technology， the First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University， He"nan Province， Weihui 453100， China； 2.Department of Oncology， the First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University， He"nan Province， Weihui 453100， China； 3.The Second Department of Thoracic Surgery， the First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University， He"nan Province， Weihui 453100， China
[Abstract] Objective To investigate the expression of CD137/CD137L in esophageal cancer， and analyze the significance and correlation with disease prognosis. Methods The esophageal tissue chip purchased from Xinchao Biological Technology co. LTD， Shanghai was taken as the research object. Immunohistochemical method was used to detect the expression of CD137/CD137L of 87 cases of esophageal cancer tissues and its corresponding adjacent tissues in the tissue chip. Chi-square test or Fisher"s inspection method was used to analyze the relationship of the expression of CD137/CD137L and the clinical pathological features in esophageal cancer tissue and corresponding adjacent tissue. Kaplan-Meier method was used to analyze the relationship between the expression of CD137/CD137L and the prognosis of esophageal cancer. Results The positive expression rate of CD137 in 87 cases esophageal cancer tissues and corresponding adjacent tissue was 36.8% and 72.4% respectively， the difference was statistically significant （P < 0.05）. The positive expression rate of CD137L in 87 cases esophageal cancer tissues and corresponding adjacent tissue was 57.5% and 96.6% respectively， the difference was statistically significant （P < 0.05）. The positive expression rate of CD137 in esophageal carcinoma tissues was related to depth of invasion （P < 0.05）， but no relation with gender， age， tumor site， differentiated degree and clinical stage （P > 0.05）. The positive expression rate of CD137L in esophageal carcinoma tissues was related to clinical stage （P < 0.05）， but no relation with gender， age， tumor site， differentiated degree and depth of invasion （P > 0.05）. The expression rate of CD137 was not related with the prognosis of esophageal cancer （P=0.6301）. The expression rate of CD137L was related with the prognosis of esophageal cancer （P=0.0368）. Conclusion The expression level of CD137L is a prognostic factor of esophageal cancer； CD137/CD137L may play an important role in antitumor immunity of esophageal cancer.
[Key words] Esophageal cancer； CD137； CD137L； Prognosis
食管癌是我国常见的消化道恶性肿瘤，其发病率在所有肿瘤中居第4位[1]。尽管有多种治疗策略，但食管癌5年生存率仍低于40%[2]，新的治疗手段仍有待进一步研发和探索。近些年来研究发现免疫治疗有望成为新的肿瘤治疗方法。众所周知，T淋巴细胞在抗肿瘤免疫中发挥主要作用，而T淋巴细胞的激活需要抗原呈递信号与协同刺激信号的双重协同刺激。研究发现，通过应用特定协同刺激分子的激动性或者抑制性单克隆抗体信号来调节机体的抗肿瘤免疫反应可达到抗肿瘤的效果[3]。CD137/CD137L是继PD-1/PD-L1、CD28/B7之后的又一重要的共刺激分子。CD137具有促进活化T细胞向肿瘤部位转移、抑制活化T细胞的凋亡、增强毒性杀伤T细胞的杀伤毒性的作用[4]。因此CD137/CD137L一度成为肿瘤免疫治疗领域的研究热点。近些年来，特异性的激动型抗CD137单克隆抗体被开发并进行临床实验，初步显现出其增强机体抗肿瘤免疫应答的作用[5-6]。然而CD137/CD137L在食管癌中表达情况还少有文献报道，因此本研究通过检测分析食管癌中CD137/CD137L的表达，并对比相应临床病理特征来探讨两者在食管癌中表达的意义及与预后的关系，为CD137/CD137L相关的免疫治疗在食管癌中的应用提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
食管癌组织芯片购自上海芯超生物科技有限公司，产品编号：[食管，180] HEso-Squ180Sur-03，所有患者术前均未接受过任何治疗，具有完整的临床资料；CD137单克隆抗体购自美国Abcam公司；CD137L单克隆抗体购自SinoBiological公司。山羊抗兔单克隆抗体、DAB显色液、过氧化氢均购自上海基因科技生物公司；改进型枸橼酸盐抗原修复液购自博士德生物公司；山羊血清购自碧云天生物科技有限公司。
1.2 方法
将组织芯片進行常规脱蜡、复水，然后按照标准的免疫组织化学操作流程逐步进行抗原修复、中和内源性的过氧化氢酶、血清封闭、滴加一抗（浓度1∶50）、4℃过夜、滴加二抗（浓度1∶100）、DAB显色、复染、中性树胶封片、观察。用PBS代替一抗作为阴性对照。对于阳性染色结果的判定采用双盲法进行，由2名高年资病理科医师独立读片。结果判定：CD137和CD137L的阳性表达主要定位于细胞质及细胞膜，阳性表达表现为黄色或棕黄色颗粒。每张切片随机挑选5个视野（400×），统计细胞数，先根据阳性细胞所占的百分数计分：<5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分；再根据阳性细胞着色程度计分：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，褐黄色为3分。将两者相乘所得的总分进行结果判定，分别对应4种表达强度。阴性（-）：评分0～1分，弱阳性（+）：评分2～4分，中度阳性（++）：评分5～8分，强阳性（+++）：评分9～12分；将“+～+++”统计为阳性。
1.3 统计学方法
采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验或Fisher"s精确检验；采用Kaplan-Meier法比较生存情况，并行log-rank检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 食管癌和相应癌旁组织中CD137的表达情况
食管癌细胞上CD137无明显可见的阳性表达。87例食管癌组织中有32例CD137表达阳性，阳性率为36.8%；相应癌旁组织中CD137表达阳性63例，阳性率为72.4%；两者比较差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1、图1（封四）。
2.2 食管癌和相应癌旁组织中CD137L的表达情况
87例食管癌组织中，CD137L表达阳性50例，阳性率为57.6%，显著低于相应癌旁组织中的96.6%，两者比较差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1、图1（封四）。
表1 CD137、CD137L在食管癌和相应癌旁组织中表达情况（例）
2.3 食管癌组织中CD137表达与临床病理特征的关系
在87例食管癌组织中CD137阳性表达率与患者的年龄、性别、肿瘤部位、分化程度、临床分期均不相关（P > 0.05），而与浸润深度相关（P < 0.05）。见表2。
表2 食管癌组织中CD137表达与临床病理特征的关系（例）
2.4 食管癌组织中CD137L表达与临床病理特征的关系
在87例食管癌组织中CD137L阳性表达率与患者的年龄、性别、肿瘤部位、分化程度、浸润深度均不相关（P > 0.05），而与临床分期相关（P < 0.05）。见表3。
2.5 食管癌组织中CD137、CD137L的表达与患者预后相关性
食管癌组织中CD137表达与食管癌患者的预后不相关（P=0.6301）；CD137L表达与食管癌患者的预后相关（P=0.0368）。见图2、3。
3 讨论
肿瘤的免疫治疗是运用免疫调节分子增强机体抗肿瘤反应来治疗肿瘤的新方法。协同刺激分子是一类在机体免疫反应中发挥重要作用的调节分子。其中，CD137及其配体CD137L是继CD28/B7之后的又一重要的协同刺激分子。研究表明，CD137主要表达于活化的T细胞、自然杀伤细胞、单核细胞表面[7]，具有促进T细胞增殖分化、促进细胞因子产生[8]、增强毒性杀伤细胞活性[9]的功能。另有研究显示，CD137固有表达CD4+CD25+免疫调节性T细胞[10]。而机体抗肿瘤免疫反应主要依赖于T淋巴细胞介导的细胞免疫[11]。这都提示CD137在抗肿瘤免疫反应中发挥重要作用。
CD137属于肿瘤坏死因子超家族的一种跨膜糖蛋白，其主要表达于活化的T细胞、NK细胞以及树突状细胞表面[7]。然而CD137在实体肿瘤细胞上表达情况颇有争议。Broll等[12]研究发现，CD137在恶性肿瘤中呈现高表达，而在良性肿瘤、炎症及正常组织中不表达，阳性表达主要分布于肿瘤组织的血管壁上。新近的研究发现[13]，霍奇金淋巴瘤的RS细胞上亦存在CD137的表达，其阳性表达率为85.7%。而在一项结肠癌的研究中发现，结肠癌细胞上CD137的表达呈阴性[14]。为研究CD137在食管癌组织细胞中的表达，本研究采用免疫组织化学的方法对87例食管癌组织和相应癌旁组织中的CD137表达进行检测。结果显示，食管癌组织中CD137的阳性表达主要分布于肿瘤的间质细胞中，87例食管癌组织中有32例为阳性，阳性率为36.8%，而在食管癌肿瘤细胞中CD137的表达均为阴性；而CD137在相应的癌旁组织中的表达阳性率为72.4%，明显高于食管癌组，两者比较差异有统计学意义（P < 0.05）。
CD137需要与其唯一的配体CD137L相结合形成复合物才能发挥其生物活性[15]，其分子机制目前还不太清楚。研究证实，CD137L表达于多数实体性肿瘤细胞上[16]。本研究通过对87例食管癌组织中CD137L的表达情况进行检测分析，也证实了这一观点；食管癌组织中CD137L的表达阳性率为57.6%，明显低于相应癌旁组织中CD137L的阳性表达（96.6%），两者差异有统计学意义（P < 0.05）。
肿瘤组织中低表达和不表达免疫共刺激分子是肿瘤免疫逃逸的机制之一[17]。本研究显示，食管癌组织中CD137和CD137L的表达水平均低于癌旁组织，表明在食管癌中存在免疫共刺激分子的表达抑制，其具体的分子机制尚不清楚。研究证实，激活机体抗肿瘤免疫的关键是免疫细胞识别肿瘤组织中的特异性抗原，而肿瘤组织中常低表达或不表达特异性的抗原[18]，这也是肿瘤细胞逃避免疫监视的重要原因。另外，肿瘤组织中存在转化生长因子-β、白介素-10[19]等免疫抑制因子的免疫抑制作用導致肿瘤组织内活化的T淋巴细胞减少，而CD137主要表达于激活状态的T细胞上，因此推测食管癌中CD137阳性淋巴细胞数低于相应癌旁组织可能与此相关。
本研究将食管癌中CD137和CD137L的表达与患者临床病理资料进行对比分析发现，CD137的表达与患者的年龄、性别、肿瘤部位、分化程度、临床分期均不相关（P > 0.05），而与浸润深度相关（P < 0.05），即随着食管癌浸润深度的增加，CD137的表达逐渐降低；CD137L的表达与患者的年龄、性别、肿瘤部位、分化程度、浸润深度均不相关（P > 0.05），而与临床分期相关（P < 0.05），即随着临床分期的增加，CD137L的表达逐渐降低。提示食管癌中CD137和CD137L的表达可能与患者不良预后相关。本研究分别对87例食管癌患者的生存期进行生存分析，结果显示，CD137L的表达与食管癌患者的预后相关（P=0.0368），而CD137的表达与食管癌患者的预后不相关（P=0.6301）。这可能与CD137在食管癌组织中存在表达抑制相关。同时也为CD137和CD137L相关的免疫治疗在食管癌中的应用提供了一个理论基础。
综上所述，本研究通过免疫组化的方法初步证实了食管癌组织中CD137和CD137L的表达均低于相应的癌旁组织。CD137和CD137L在食管癌中的表达分别与浸润深度和临床分期相关。由此推测CD137/CD137L可能在食管癌的抗肿瘤免疫中发挥重要作用。这为CD137/CD137L相关的免疫治疗在食管癌中的应用提供了理论基础，但本研究还存在诸多的不足之处，为了得到更精确的评估，还需要大样本研究和长时间随访进一步验证。
[参考文献]
[1] Jemal A，Bray F，Center MM，et al. Global cancer statistics [J]. CA Cancer J Clin，2011，61（2）：69-90.
[2] Tepper J，Krasna MJ，Niedzwiecki D，et al. Phase Ⅲ trial of trimodality therapy with cisplatin，fluorouracil，radiotherapy，and surgery compared with surgery alone for esophageal cancer：CALGB 9781 [J]. J Clin Oncol，2008，26（7）：1086-1092.
[3] Melero I，Grimaldi AM，Perez-gracia JL，et al. Clinical Development of Immunostimulatory Monoclonal Antibodies and Opportunities for Combination [J]. Clin Cancer Res，2013，19（5）：997-1008.
[4] Ye Q，Song DG，Poussin M，et al. CD137 accurately identifies and eiches for naturally occurring tumor-reactive T cells in tumor [J]. Clin Cancer Res，2013，20（1）：44-55.
[5] Kohrt HE，Colevas AD，Houot R，et al. Targeting CD137 enhances the efficacy of cetuximab [J]. J Clin Invest，2014，124（6）：2668-2682.
[6] Kohrt HE，Houot R，Weiskopf K，et al. Stimulation of natural killer cells with a CD137-specific antibody enhances trastuzumab efficacy in xenotransplant models of breast cancer [J]. J Clin Invest，2012，122（3）：1066-1075.
[7] Carpenito C，Milone MC，Hassan R，et al. Control of large，established tumor xenografts with genetically retargeted human T cells containing CD28 and CD137 domains [J]. Proc Natl Acad Sci U S A，2009，106（9）：3360-3365.
[8] Thum E，Shao Z，Schwarz H. CD137，implications in immunity and potential for therapy [J]. Front Biosci（Landmark Ed），2009，14（14）：4173-4188.
[9] Da FD，PAuzmendi PJ，Pena D，et al. Bayesian approach to model CD137 signaling in human M. tuberculosis in vitro responses [J]. Plos One，2013，8（2）：e55987.
[10] Liu GZ，Gomes AC，Fang LB，et al. Decreased 4-1BB expression on CD4+CD25 high regulatory T cells in peripheral blood of patients with multiple sclerosis [J]. Clin Exp Immunol，2008，154（1）：22–29.
[11] Lee MC，Buitrago DH，adota KK，et al. The tumor immune microenvironment in octogenarians with stage I non-small cell lung cancer [J]. Oncoimmunology，2014，3（11）：e967142.
[12] Broll K，Richter G，Pauly S，et al. CD137 expression in tumor vessel walls. High correlation with malignant tumors [J]. Am J Clin Pathol，2001，115（4）：543-549.
[13] Ho WT，Pang WL，Chong SM，et al. Expression of CD137 on Hodgkin and Reed-Sternberg cells inhibits T-cell activation by eliminating CD137 ligand expression [J]. Cancer Res，2013，73（2）：652-661.
[14] 周思君，詹俊.CD137/CD137L、白细胞介素-2在大肠癌中的表达及其临床意义[J].临床内科杂志，2015，8（4）：260-262.
[15] Chang HY，Lee HM，Sang CL，et al. Involvement of CD137 ligand signaling in neural stem cell death [J]. Mol Cells，2013，36（3）：245-251.
[16] 張利宁，李长菲，王振光，等.人CD137L在肿瘤细胞上的表达及功能研究[J].上海免疫学杂志，2003，23（5）：327-330.
[17] Baxter AG，Hodgkin PD. Activation rules：the two-signal theories of immune activation [J]. Nat Rev Immunol，2002， 2（6）：439-446.
[18] Makkouk A，Chester C，Kohrt HE. Rationale for anti-CD137 cancer immunotherapy [J]. Eur J Cancer，2016，54：112-119.
[19] Musuraca G，Matteis SD，Napolitano R，et al. IL-17/IL-10 double-producing T cells：new link between infections， immunosuppression and acute myeloid leukemia [J]. J Transl Med，2015，13（1）：1-10.
（收稿日期：2016-09-21 本文编辑：程 铭）