摘 要：为了解色素相关基因和体色之间的关系，应用实时荧光定量PCR（qPCR）技术分析血鹦鹉的酪氨酸酶（tyrosinase，TYR）基因的表达谱，通过Primer 5 软件设计扩增血鹦鹉TYR基因片段的引物并进行qPCR评估研究。结果显示，引物TYR2F-TYR2R在qPCR扩增时，融解曲线为单一尖锐峰；标准曲线分析显示，引物的扩增效率为103.3%，R2值为0.994。上述结果说明该对引物具有良好的扩增特异性和扩增效率，满足了qPCR扩增的要求，该研究结果可为血鹦鹉TYR基因表达的qPCR分析奠定基础。
关键词：血鹦鹉；酪氨酸酶基因（TYR）；实时荧光定量PCR；融解曲線
中图分类号：S965.8 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.12.014
Abstract： To understand the relationship between the related genes and body color pigment， the application of real-time fluorescent quantitative PCR （qPCR） technical analysis blood parrot tyrosinase， tyrosinase， TYR） gene expression profile， this research designed blood parrot TYR gene primers and qPCR assessment through the Primer amplification 5 software. The results showed that the melting curve was a single sharp peak when the primer TYR2F-TYR2R was amplified by qPCR. The standard curve analysis showed that the amplification efficiency of primers was 103.3% and R2 was 0.994. The above results showed that the primers have good amplification specificity and amplification efficiency and meet the requirement of qPCR amplification. This study will lay a foundation for the qPCR analysis of TYR gene expression.
Key words： Amphilophus； tyrosinase gene （TYR）； real-time fluorescence quantitative PCR； melting curve
体色是鱼类独特的表型性状和经济性状[1]， 观赏鱼类的体色和斑纹直接决定其观赏价值和市场价值。随着人们对观赏鱼要求的提高，如何增强观赏鱼的观赏性成为一个重要的问题。许多鱼类从仔鱼阶段到幼鱼阶段都会有一个“体色褪黑”的现象，如血鹦鹉鱼、日本锦鲤、小丑鱼等[2]。目前，生产中常利用体色完全褪黑的血鹦鹉进行扬色，然而，体色褪黑的程度往往不符合生产的需求，如血鹦鹉会出现返黑现象。因此，深入了解鱼类体色褪黑的机制，寻找人工改良体色的方法，非常值得研究。
鱼类体色的形成和维持受到一系列细胞、基因和生理因素的复杂调控[3]，其体色构成不仅与色素合成有关，更取决于所含色素细胞的种类、数量、分布及色素细胞之间的相互作用[4]。关于鱼类色素细胞的分类目前有很多种说法，普遍认为，鱼类色素细胞主要有6种类型：红色素细胞、黄色素细胞、虹彩细胞、黑色素细胞、白色素细胞、蓝色素细胞[5]。目前，已知腺苷酸环化酶、酪氨酸激酶、蛋白激酶三种信号通路，都能调控黑色素合成，并且激活其中任意一个信号通路均能激活细胞增殖或黑色素颗粒的形成[6]。黑色素颗粒吸收特定波长的光使其体现为黑色，这是由酪氨酸和多巴胺通过一系列复杂的反应合成的[7]。具体过程可简化为酪氨酸—多巴—多醌—多巴色素—5，6-二羟基吲哚酸或5，6-二羟基吲哚—5，6吲哚醌--真黑素[8]。
大量研究证明，有多个基因参与鱼类色素细胞形成和色素细胞间的相互作用[5，9-12]，其中，在一系列复杂的基因中，酪氨酸酶（Tyrosinase， TYR）基因在黑色素形成中起着关键性作用，TYR是动物体内黑色素合成信号通路中最重要的限速酶之一[13]， 其表达量和活性水平决定着黑色素形成的种类和速度，若TYR提前终止转录，黑色素则无法合成，进而会造成白化现象等。
血鹦鹉鱼（Blood parrot fish）是由紫红火口（Cichlasoma synspilum）为母本、红魔鬼鱼为父本（Cichlasoma citrinellum）杂交而成的，属淡水热带观赏鱼类，体形肥胖，全身鲜艳通红。因其色彩艳丽，嘴型酷似鹦鹉嘴型而得名，因此深受鱼迷们喜爱[14]。血鹦鹉鱼的体色变化过程不同于其他观赏鱼品种，仔鱼期为黑色，逐渐褪去变成黄色，添加色素后，鱼体变红。为了培养出高品质的观赏鱼，必须添加外源色素，但目前对于观赏鱼着色机理的研究还比较少。
实时荧光定量PCR（real-time fluorescencequantitative PCR，qPCR）是指在反应体系中加入荧光分子，分析和检测反应过程中的累积扩增产物，其结果可以用于定性和定量分析。qPCR 可以应用于mRNA表达的研究、DNA拷贝数的检测、单核苷酸多态性的测定、细胞因子的表达分析、肿瘤耐药基因表达的研究以及病毒感染的定量监测[15]。
为应用qPCR技术分析血鹦鹉的酪氨酸酶（tyrosinase，TYR）基因的表达谱，本试验通过扩增血鹦鹉TYR基因片段的引物并进行qPCR评估，旨在为血鹦鹉TYR基因的定量表达分析及鱼类体色遗传和体色改良研究积累资料。
1 材料和方法
1.1 材 料
供试鱼取自天津宝坻里自沽嘉禾田源养殖基地，经麻醉后，解剖其鳍、皮和眼，液氮中迅速冷冻后放入-80 ℃冰箱中，备用。
1.2 方 法
1.2.1 总RNA的提取 应用Trizol 试剂（上海生工生物工程技术服务有限公司）提取血鹦鹉的鳍、皮和眼3种组织的RNA。试验步骤如下：加入适量Trizol研磨，靜置5 min，12 000 r·min-1，4 ℃离心5 min取上清至离心管中；加入氯仿，振荡混匀，静置5 min，12 000 r·min-1离心15 min取上清；加等体积异丙醇，静置10 min，12 000 r·min-1 离心10 min弃去上清；加入75%乙醇1 mL，离心15 min，弃乙醇，保留沉淀，干燥2 min，溶入DEPC水中，溶解后用超微量分光光度计（德国IMPLEN公司）分析其纯度；然后再在1%左右的普通琼脂糖凝胶、5 V·cm-1 的恒压电泳分离，凝胶成像系统观察与拍照。
1.2.2 cDNA第一条链的合成 依照反转录试剂盒的说明书进行试验，在离心管中加入1 μL Oligo dT Primer，1 μL dNTP Mixture，计算好标定为1 000 mg·μL-1的提取得到的RNA模板溶液，再加上ddH2O配平至10 μL，放入65 ℃水浴锅中反应5 min，迅速冷却，加4 μL 5×Prime ScriptⅡ Buffer，0.5 μL RNase lahibitor，1 μL Prime ScriptⅡRTase于离心管中，最后加入4.5 μL ddH2O于45 ℃水浴中反应45 min，95 ℃水浴5 min，冷却，最后将得到的cDNA产物放入-20 ℃冰箱中保存备用。
1.2.3 引物的设计、常规PCR的筛选 依据GenBank公布的血鹦鹉近缘物种TYR的基因序列信息（GenBank号：KU308394.1），应用Primer 5.0 设计引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
取鱼的鳍、皮和眼的cDNA进行TYR基因片段的常规PCR扩增。扩增体系为25 μL，包括cDNA 1 μL，10×Buffer 2.5 μL，ddH2O 15.3 μL，dNTP 2 μL， 合成的引物各4 μL，Taq 0.2 μL。扩增条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，59.2 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共循环35～40次。PCR产物经1%左右的琼脂糖凝胶、5 V·cm-1 的恒压电泳分离，凝胶成像系统观察与拍照。之后对得到的TYR基因的单一PCR扩增产物进行双向测序，测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。
1.2.4 qPCR引物的设计与评估 根据本试验获得的TYR基因序列以及qPCR扩增的引物设计原则，对用于qPCR分析的引物，经过常规PCR检测后，进行qPCR扩增。
根据Real Master Mix（SYBR Green I）试剂盒说明书设计反应体系，对引物进行RT-PCR反应。PCR反应体系为6 μL ddH2O，0.4 μL ROXⅡ，0.8 μL正向引物，0.8 μL反向引物，2 μL模板和10 μLSYBR。扩增条件为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性15 s，一定的退火温度退火30 s，72 ℃延伸25 s。共循环40次。
退火温度的优化：根据引物的Tm值，对TYR的基因片段进行qPCR扩增。每个反应为3个技术重复，同时进行融解分析，并设置阴性对照（用PCR水替代cDNA）。
标准曲线的建立：以cDNA原液为最高浓度，采用10倍稀释法获得5个不同浓度的cDNA模板（用PCR水替代cDNA）。
2 结果与分析
2.1 总RNA的提取及检测结果
血鹦鹉鳍、皮和眼3种组织的总RNA经检测显示，28 S rRNA和18 S rRNA条带亮度比值在1～2（图1），OD260/OD280均在1.8～2.0。
2.2 引物的设计、常规PCR的筛选
根据GenBank检索的血鹦鹉近缘物种TYR的基因序列，应用Primer 5.0引物设计得出的引物中，只有1对引物（表1）适宜进行PCR扩增。
以血鹦鹉鳍、皮、眼的cDNA为模板，对表1引物进行常规PCR扩增筛选。图2结果显示，引物TYR-F，TYR-R的扩增产物仅有一个扩增条带（泳道1～3），大小与理论值相符。
对扩增后获得的单一产物进行测序，其序列包含引物为293 bp。对该序列进行GenBank BLAST比对，结果显示，TYR基因与已报道的近缘物种橘色双冠丽鱼的cDNA序列（GenBank号：KU308394.1）一致性为99%；与紫蓝叮当的一致性为89%（GenBank号：AB178940.1）；与蓝马面的一致性为89%（GenBank号：AB178937.1）；与喷点珍珠虎的一致性为89%（GenBank号：AB178936.1）；与非洲慈鲷的一致性为89%（GenBank号：AB178939.1）（表2）。
2.3 qPCR引物的设计与评估
2.3.1 qPCR引物的设计 根据试验所得的基因序列，设计并得到2对qPCR扩增的产物（表3）。
试验所得的序列为：CGGGGCTACAGCCAAGAGCACTGTGTAACGCCACCGGGGAGGGTCCACTGTTACGTAATCCCGGTAACCATGATTCCAATCGTGTGCAACGAATTCCACTTCGGCTGATGTGGAGTTCACTTTGGGCCTCCCCGAGTACGAGACGGGAACCATGGACCGCTTTGCAACATGAGCTTTAGAAACGTATTAGAGGGTTTTGCAAGTCCAGAGACAGGTATGGCCCTGACAGGCCAGAGTACCATGCACAACTCCTTGCATA。
2.3.2 qPCR引物的评估 根据TYR1F-TYR1R和TYR2F-TYR2R的Tm值，进行qPCR温度梯度试验的扩增，结果显示，TYR2F-TYR2R在退火温度为57 ℃时的Ct值最小（表4），所以，引物TYR2F-TYR2R用于qPCR的扩增。
采用退火温度57 ℃，应用引物TYR2F-TYR2R对系列稀释cDNA样本进行qPCR扩增，结果显示，在指数扩增区相邻的扩增曲线间隔相似（图3-A），每个反应的融解曲线为单一尖锐峰（图3-B），从标准曲线得出引物的扩增效率为103.3%，标准曲线的相关系数R2值为0.994（图3-C）。
3 结论与讨论
总RNA的纯度和完整性关系到后面的cDNA合成及PCR扩增。因此，所提的总RNA要求纯度高，完整性好并达到一定的浓度。本研究表明，从血鹦鹉中提取的总RNA样本的28 S/18 S rRNA的条带亮度比值在1～2，而OD260/OD280在1.8～2.0，没有蛋白的污染。表明总RNA有较好的完整性，可用于后续的试验。
引物的设计一般应遵循以下原则：引物的GC含量在50%～60%较为合适，避免序列中连续出现超过3个G或C重复片段；引物的Tm值在50～65 ℃之间，且上下游引物的Tm值的差在5 ℃以内，可增加PCR反应成功的可能性，引物自身和引物间不应存在互补序列，从而避免产生发夹结构和引物二聚体[16]；而对于qPCR扩增还要求扩增子的长度最好在75～200 bp之间，片段越长扩增效率越低。本试验基于GenBank公布的血鹦鹉鱼近缘物种所得的基因序列（KU308394.1），仅得到1对引物，即：TYR-F和TYR-R，扩增子理论大小值为293 bp，在常规PCR中，引物的扩增子理论大小值为293 bp与理论值相符且无杂带，特异性较强。基于该引物序列，进一步设计用于qPCR试验的引物，得到2对用于qPCR试验的引物。扩增子理论大小值分别为112，161 bp。之后经过qPCR温度梯度扩增试验，结果显示，TYR2F-TYR2R引物更适合用于qPCR的试验。
在qPCR扩增时，每次均应设置阴性对照，且无扩增信号；所有的扩增样本都应有2～3 个技术重复，同时技术重复样本的Ct值的标准差应<0.5，否则应对样本重新进行qPCR扩增。本试验中的阴性对照均无扩增信号，qPCR扩增样本的3个重复的Ct值标准差<0.5，说明了本试验结果的可靠性。
退火温度的高低影响引物与目标序列的退火，不适宜的退火温度会导致非特异性扩增和引物二聚体的形成，因此，在qPCR试验中，要进行退火温度的优化。引物扩增的特异性是qPCR分析成败的关键，因此在进行退火温度优化的同时要进行融解分析，判断引物扩增的特异性[17]。融解曲线若为单一尖锐峰，则表明引物的qPCR扩增为特异性反应；相反，如果在融解曲线上不只有一个波峰，则表明有非特异性的反应，应淘汰该引物[18]。依据本试验引物的Tm值，经过优化，结果显示，退火温度为57 ℃时，qPCR扩增的Ct值最小，故选择57 ℃作为退火温度对引物进行扩增效率的检测。
引物除了具有扩增特异性外还应具有良好的扩增效率，才能最终用于试验样本的qPCR 分析。qPCR的扩增效率一般通过建立标准曲线来确定，而标准曲线可通过对一系列倍比稀释的cDNA模板进行qPCR而得出。扩增标准：扩增曲线应间隔均匀、理想的扩增效率在90%～105%、标准曲线的决定系数（R2）>0.980[19-20]。本试验结果显示，引物TYR2F-TYR2R在qPCR扩增时，融解曲线为单一尖锐峰；标准曲线分析显示：引物的扩增效率为103.3%，R2值为0.994。上述结果说明，该对引物具有良好的扩增特异性和扩增效率，满足了qPCR扩增的要求。
通过对引物TYR2F-TYR2R的退火温度优化和标准曲线的建立，结果表明，该引物可适用于样本的qPCR分析，这一研究将为TYR基因表达量与血鹦鹉体色变化的关系及研究鹦鹉鱼体色形成机制提供理论依据。
参考文献：
[1]HELEN N S， SARA， MARGARETA W.Rapid color change in fish and amphibians - function， regulation， and emerging applications[J].Pigment cell & melanoma research，2013，26（1）：29-38.
[2]蒋燕玲，宋红梅，刘奕，等.橘色双冠丽鱼TYR基因的克隆及其发育时序和组织表达分析[J].农业生物技术学报，2016，24（5）：697-707.
[3]NELSON C. Genetics of salmonid skin pigmentation： clues and prospects for improving the external appearance of farmed salmonids[J].Reviews in fish biology and fisheries，2010，20（1）：71-86.
[4]MASAFUMI I， HIROAKI Y， SHIGERU K. Pigment pattern formation by contact-dependent depolarization[J].Science （New York， N.Y.），2012，335（669）：677.
[5]田雪，龐小磊，王良炎，等.MITFa及TYR基因在红色锦鲤体色发生不同阶段的表达分析[J].水产科学，2017，36（2）：197-201. [6]伍革民，彭光旭.动物黑色素研究进展[J].甘肃畜牧兽医，2005，35（1）：39-41.
[7]NORIKO O， NAOHIKO N， SACHIKO A，et al.Comparative analyses of the pigment-aggregating and -dispersing actions of MCH on fish chromatophores[J].Comparative biochemistry and physiology toxicology & pharmacology ： CBP，2001，129（2）：75-84.
[8]舒文，毛華明.黑色素的研究进展[J].国外畜牧学：猪与禽，2003，23（2）：31-34.
[9]JAMES E N M， SIMON M H.Sequential actions of Pax3 and Pax7 drive xanthophore development in zebrafish neural crest[J].Developmental biology，2008，317（2）：508-522.
[10]HIRATA M，NAKAMURA K I，KANEMARU T，et al.Pigment cell organization in the hypodermis of zebrafish[J].Developmental dynamics ： an official publication of the American association of anatomists，2003，227（4）：497-503.
[11]STONE E， JAMES A L， TOM J C，et al.Transcriptional regulation of mitfa accounts for the sox10 requirement in zebrafish melanophore development[J].Development for advance in developmental biology and stem cells，2003，130（12）：2809-2818.
[12]OSHIMA N，NAKATA E，OHTA M，et al.Light-induced pigment aggregation in xanthophores of the medaka， Oryzias latipes[J].Pigment cell research，1998，11（6）：362-367.
[13]HAN R，BADEN H P，BRISSETTE J L，et al.Redefining the skin"s pigmentary system with a novel tyrosinase assay[J].Pigment cell & melanoma research，2002，15（4）：290-297.
[14]洪纬.明清以来传统鱼类分类方法研究（1491-1947）——以福建省为中心[D].上海：上海交通大学，2013.
[15]邓文星，张映.实时荧光定量PCR技术综述[J].生物技术通报，2007 （5）：93-95， 103.
[16]黄可.引物和探针核苷酸错配对PCR灵敏度和特异性影响的研究[D].扬州：扬州大学，2017.
[17]王香君，李梦茹，段杉.实时荧光定量PCR法定量微生物的条件及在鱼露和虾油微生物检测中的应用研究[J].食品与发酵工业，2018，44（2）：194-201.
[18]白雪芹，杨瑞瑞，曾幼玲.不同引物对和退火温度对盐生植物盐穗木内参基因β-actin扩增效率的影响[J].新疆农业科学，2017，54（2）：352-360.
[19]ISBEL T， ERIK V B， MARC D L.Cloned plasmid DNA fragments as calibrators for controlling GMOs： different real-time duplex quantitative PCR methods[J].Analytical and bioanalytical chemistry，2004，378（5）：1198-1207.
[20]METI B G， TORSTEIN T， JOSE L L P，et al.Comparison of nine different real-time PCR chemistries for qualitative and quantitative applications in GMO detection[J].Analytical and bioanalytical chemistry，2010，396（6）：2023-2029.